文献分享 | 绿色荧光蛋白（eGFP）报告系统的构建

XMU-CHINA

1. 论文基本信息

论文名称：Z. Ding et al., Identification of the anchoring protein SpoIIIJ for construction of the microbial cell surface display system in Bacillus spp. International Journal of Biological Macromolecules 133, 614-623 (2019).

主要内容：构建绿色荧光蛋白（eGFP）报告系统，评估了所选膜蛋白的细胞展示效率，获得了具有最强锚定活性的锚定蛋白SpoIIIJ，并设计了连接锚定蛋白 SpoIIIJ和eGFP的连接子，使融合蛋白的表达量提升了58.32%。最后利用该系统成功在芽孢杆菌属细胞表面表达了两种与生物修复相关的蛋白（有机磷水解酶OPHC2和金属结合蛋白CadR）。

2. 研究背景

微生物表面展示技术将异源蛋白与宿主细胞中的锚定蛋白融合，使目标蛋白展示在微生物细胞表面。与可溶性蛋白及传统的固定化蛋白相比，细菌细胞表面展示的蛋白稳定性更高、更易回收，且无需对蛋白进行纯化，可以降低成产成本。近几十年多种表面展示系统相继问世，如T4噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、酵母表面展示系统、细菌表面展示系统（包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌展示系统）。

枯草芽孢杆菌是一种环境友好型革兰氏阳性菌，可用于饲料、污水处理和生物肥料的发酵。其蛋白表达系统稳定性高，无明显的密码子偏好，可用于表达高分子量或多聚蛋白。枯草芽孢杆菌孢子中有多种衣壳蛋白可展示目标蛋白，如cotB，CotC，CotG，CotY和CotZ等。

然而，这些都是枯草芽孢杆菌在极端环境条件下所形成的包子的相关的衣壳蛋白，而在条件较为温和的情况下，枯草芽孢杆菌通常以营养细胞存在，在孢子中起作用的锚定蛋白无法在枯草芽孢杆菌营养细胞中发挥作用。寻找一种能在枯草芽孢杆菌细胞表面持续稳定表达、具备展示多种蛋白的能力以适应不同环境应用的锚定蛋白至关重要。

3. 研究内容和结论

概述：利用生物信息学工具，从枯草芽孢杆菌基因组中筛选出47种有至少5个跨膜螺旋且C末端有10多个柔性氨基酸的锚定蛋白，采用荧光报告系统对其性能进行评估，选择出具有高锚定活性和稳定的SpoIIIJ，并在枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的细胞表面表达了两种与生物修复相关的蛋白，证明了该新系统的应用潜力。

1.锚定蛋白的筛选

在NCBI下载了枯草芽孢杆菌168的所有蛋白序列，利用跨膜隐马尔可夫模型（TMHMM）工具对这些序列进行分析，筛选出膜蛋白。筛选依据：至少包含五个跨膜螺旋，在C末端需有超过十个氨基酸且呈现柔性线圈二级结构，且在枯草芽孢杆菌生长的某个阶段表达。一共选择出47种潜在锚定蛋白。

2.锚定蛋白的性能评估

开发了一种增强型绿色荧光蛋白（eGFP）报告系统，使用质粒pUBC19构建基因回路：启动子-锚蛋白-eGFP-TamyL1，用于表达所选锚蛋白与eGFP的融合蛋白。在47种锚蛋白中，成功构建了包含SpoIIIJ、YugS、YdeO、YhfN、YitT、YacL、YvfF、QcrC、CtaC、YeaB、YdbO、YxkD和YhdT的质粒，并将其导入枯草芽孢杆菌WB600。

图：研究中使用的质粒载体

在该报告系统中，锚蛋白C末端与报告蛋白eGFP融合，并通过细胞荧光强度反映所选启动子-锚蛋白的性能，得到锚蛋白为SpoIIIJ的工程菌展现出最高的荧光强度，而菌落生长并无显著差异，表明SpoIIIJ是WB600细胞中适宜的锚蛋白。

图：不同锚蛋白的性能评估

3.锚定蛋白SpoIIIJ的表面展示性能评估

将SpoIIIJ的启动子和编码基因与eGFP在穿梭质粒pHY300plk2中进行融合，pHY300plk2是一种在枯草芽孢杆菌属中拷贝数较低的质粒。通过检测细胞生长28小时内的荧光强度，间接确定SpoIIIJ的表达量。得到含有重组质粒的工程菌中SpoIIIJ-eGFP的表达量随时间逐渐增加，而在含有原始质粒的菌株中无荧光被检测到，而两者的细菌的生长趋势并无显著差异。

将工程菌分别接种至迪夫科芽孢形成培养基（DSM）和LB培养基中，得到无论处于哪个生长阶段，在LB培养基中测得的SS202菌株的荧光值均显著高于在DSM培养基中测得的值，表明SpoIIIJ-eGFP融合蛋白的表达主要发生在营养细胞表面而非芽孢。

4.确定SpoIIIJ在宿主细胞中的表达位置

使用了一种能够观察细菌细胞发出的绿色荧光信号的超分辨率共聚焦显微镜对细胞进行观察，得到荧光定位于SS202细胞表面。将工程质粒转化到地衣芽孢杆菌中，以确定SpoIIIJ在不同芽孢杆菌属菌株中的功能，得到含融合蛋白的细胞表面荧光信号明显，而在仅含有eGFP蛋白的对照菌株中，荧光信号分布于整个细胞，证明了SpoIIIJ能够将异源蛋白定位到细胞表面，并具有在多种芽孢杆菌中应用的潜力。

图：用超分辨显微镜观察绿色荧光蛋白的表达位置

5.通过连接子提高SpoIIIJ的表达效率

测试了连接于SpoIIIJ和eGFP之间的六连相同氨基酸肽段的作用，得到插入6×Pro和6×Arg连接肽可提高eGFP的表达量，eGFP表达水平分别比没有连接肽时高出58.32%和5.60%。（测量时间为细胞生长24小时后）

表：融合蛋白中连接子的影响

6.有机磷水解酶的细胞表面展示表达。

将源自假单胞菌属的有机磷水解酶OPHC2与SpoIIIJ进行融合，构建携带融合基因spoIIIJ-ophc2的质粒，并将其转化到宿主菌株WB600中，得到OPHC2的酶活性随培养时间逐渐增加，且细胞破裂后酶活性并未提高，说明融合蛋白在细胞表面表达，且在地衣芽孢杆菌中也观察到相同趋势。

7.金属结合蛋白 CadR 的细胞表面展示表达。

构建了含SpoIIIJ与CadR融合蛋白的质粒，并转化工程菌，以验证金属结合蛋白CadR借助SpoIIIJ表面展示系统吸附Cd²⁺以用于生物修复的能力。得到与其它宿主菌株相比，表面展示金属结合蛋白的工程菌株SS206对Cd²⁺的去除能力提升了近7倍。为了进一步提升工程菌在农业土壤修复应用中的稳定性，采用海藻酸钠和聚乙烯醇（PVA）包埋法对表面表达CadR的工程菌进行固定化，得到在120分钟内可去除高达 80%的Cd²⁺。固定化工程菌使Cd²⁺的吸附量相较于纯海藻酸钠分别增加了15%和50%。

8.文章分析

在细菌表面展示系统中，许多因素可影响锚定蛋白的活性，如载体、宿主细胞、启动子及连接肽。在筛选过程中， 47个预测的锚定蛋白基因中仅13个成功整合入载体 pUBC19；成功构建的pUBC19-gltT无法通过任何方法引入枯草芽孢杆菌细胞。

研究对SpoIIIJ使用了多种启动子，如Pylb、P43、PspaC和Pzd，但这些启动子均未能有效促进融合蛋白的表达，部分启动子甚至导致融合蛋白完全不表达，说明合适的启动子是细胞表面展示系统开发的关键因素之一。连接肽也会影响融合蛋白的表达，如在本研究中融合蛋白之间六个连续脯氨酸可显著提升融合蛋白的表达量

4. 个人总结

本研究获得了可以在枯草芽孢杆菌营养细胞表面进行展示的锚蛋白SpoIIIJ，而现在大部分研究使用的是枯草芽孢杆菌孢子作为表面展示的载体，包括2022年的那个课题，因此这可能是我们和别人不一样的点之一，即营养细胞在表达壳聚糖酶杀菌的过程中同时发挥生物防治的作用。