IGEM文献分享 | 一种便携式的微生物全细胞生物传感平台

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1. 论文基本信息

论文名称：

Hongliang Wang, Dan Song, Yuyang Chen, Wenjuan Xu, Xiangzhi Han, Anna Zhu, Feng Long, Development of portable whole-cell biosensing platform with lyophilized bacteria and its application for rapid on-site detection of heavy metal toxicity without pre-resuscitation, Analytica Chimica Acta, Volume 1228, 2022, 340354, ISSN 0003-2670.

主要内容：

这个研究开发了一种便携式的微生物全细胞生物传感平台，结合了手持光纤溶解氧传感器以及冷冻干燥的细菌，能够实现在无需预复苏的情况下快速检测重金属离子的毒性的功能。实验结果表明，该平台具有长时间稳定性和便携性，能够实现现场高频的毒性评估，为重金属污染监测提供了一种新的解决方案。

DOI号：

https://doi.org/10.1016/j.aca.2022.340354。

关键词：

全细胞生物传感器，毒性检测，重金属离子，溶解氧传感器，冻干细菌

本次阅读目标：

学习其他文献中，通过构建便携式检测器，进行基于生物传感器的检测的思路和方案。尤其是冻干大肠杆菌的思路。

2. 研究背景

重金属是无处不在的环境污染物 ，具有剧毒、不可生物降解、可生物累积且可能致命的。许多国家和组织都设定了重金属的最大允许暴露标准。快速和高频的测量对于过程监测和及时处理污染物事故至关重要。传统的分析方法，如电感耦合等离子体质谱法、原子吸收光谱法和电感耦合等离子体原子发射光谱法，具有高度的灵敏度和准确性。然而，使用这些方法很难确定重金属离子在生命系统中的生物利用度和急性毒性。此外，这些技术需要昂贵的仪器、复杂的样品制备和较长的分析时间。因此，基于使用生物体（包括鱼、虾和片足类）进行暴露测试的各种方法已广泛用于急性毒性检测。然而，它们通常耗时、昂贵、不便携，并且无法满足对事故的快速应急响应要求。

另一种基于生物传感器的检测方式——微生物全细胞生物传感器，已被用于测量污染物毒性（例如重金属离子），因为它们易于培养、成本效益高，并且作为生物受体对外部刺激反应迅速，没有道德风险。在所有市售产品中，最吸引人的毒性检测机制涉及生物发光细菌的代谢活性。然而，使用生物发光细菌的主要缺点之一是，具有浑浊 、吸收光或猝灭发光效应的样品不可避免地会干扰分析。此外，许多生物发光细菌需要高渗和高盐度环境，这可能会影响重金属离子的溶解度、生物利用度和形态形成，从而导致结果不准确。因此，迫切需要一种更快速、便携、经济和即用型生物传感器，以实现现场重金属离子的现场高频毒性评估。

分子氧是细菌和高等生物的重要代谢产物，氧摄取的变化可以成为其代谢状态和对外源性或内源性刺激反应的重要标志。基于呼吸抑制（或耗氧抑制）机制，对各种重金属特别敏感的微生物全细胞生物传感器已成功应用于毒性评估。 在这些系统中，快速准确地测量溶解氧 （DO） 对于微生物全细胞生物传感器的性能至关重要。基于荧光的溶氧传感器因其出色的特性而成为方便且用途广泛的工具。然而，为了在重金属离子的快速现场毒性检测中应用微生物全细胞生物传感器必须满足几个要求：

（1） 细菌细胞在储存和运输到现场的过程中必须保持长期的活力、活性和稳定性;

（2） 由毒性反应引起的耗氧量抑制必须在微生物呼吸以外的因素的最小干扰下进行检测;

（3） 即用型检测需要应用微生物全细胞生物传感器来检测现场的真实样品。

然而，现有的微生物全细胞生物传感器难以满足所有这些要求。

因此，这个研究构建了一种新型便携式微生物全细胞生物传感平台，通过集成手持式光纤溶氧传感器和基于呼吸抑制机制的冻干细菌来评估重金属的毒性。为了实现 DO 的实时准确检测，基于全光纤结构和相移测量原理，开发了一种集成的手持式光纤 DO 传感器。在该装置中，一种新的多模光纤束用于激发光和荧光的同时传输。光纤光斑是通过在光纤束末端涂覆 O2 传感箔来制造的，其尺寸足够小 ，可以在小体积样品 （<1.0 mL） 中进行 原位溶解氧检测。如前所述，由于缺乏细胞生长，冻干是维持细菌长期活性和稳定性的有效方法。在本研究中提出了一种有效的细菌冻干方法，该方法可以直接应用于即用型重金属毒性测定，无需预复苏。

3. 大肠杆菌冻干的制备

制备冻干菌体时，取2.0 mL大肠杆菌培养悬液分装至5.0 mL离心管，10000 rpm离心10分钟。弃上清后，离心所得菌体不经洗涤直接置于-80℃冷冻12小时，再真空干燥12小时。冻干后的大肠杆菌分别保存于4℃、-20℃或-80℃环境，供后续实验使用。

4. 实验结果及实验讨论

1. 便携式微生物全细胞生物传感平台测试条件的优化

在构建出了便携式微生物全细胞生物传感平台后，研究人员优化了几个测试条件。 大肠杆菌浓度是决定全细胞生物传感器性能的关键因素。为了确定最佳大肠杆菌浓度，引入了如下灵敏度指数（ε）：ε = Rs/Rb

其中 Rb 和 Rs 分别是不含重金属离子和含重金属离子的 OCR。选择 Hg2+ 作为标准毒物，评价微生物全细胞生物传感器的反应。使用连续稀释的大肠杆菌进行实验。大肠杆菌浓度增加导致 OCR 增加。当大肠杆菌浓度为 1.0 × 108 cfu/mL 时，从样品空气饱和状态切换到脱氧状态所需的时间最短（小于 20 min）。当向水样中加入 20 μg/L Hg2+ 时，所有样品的 OCR 均降低。OCR 抑制随着大肠杆菌浓度的增加而改善。这是因为在相同的毒物浓度下， 微生物细胞呼吸随着浓度的增加而受到越来越多的抑制，这与以前的报道一致。 虽然在 1.0 ×10 7 cfu/mL 时获得了更高的灵敏度指数，但考虑到现场快速检测要求和细胞培养条件，选择相对较高的大肠杆菌浓度 （5.0 ×10 7 cfu/mL） 作为后续毒性测量的最佳浓度。为了缩短测量周期，测试时间设置为 18 min。

细菌的代谢活动在很大程度上取决于温度。下图显示了含有 5.0 ×7 cfu/mL 大肠杆菌的样品 （pH = 7.0） 在不同温度下的氧饱和度变化。在相对较低的温度 （< 20 °C） 下，耗氧量非常缓慢，因为 大肠杆菌的代谢活性降低。随着温度的升高， 大肠杆菌 OCR 逐渐增加，在 ∼40 °C 时获得最大 OCR。然而，较高的温度 （> 40 °C） 抑制了微生物细胞的代谢活性，导致 OCR 偏低。尽管在 ∼40 °C 时可以获得最高的呼吸活动，但在如此高的温度下可能会发生重金属的水解。因此，选择合适的孵育温度 37 °C 进行毒性试验 。

pH 值是影响细菌代谢活动的另一个重要因素。不同 pH 值下大肠杆菌的耗氧量曲线如图所示。当 pH 值低于 7.0 时，OCR 会随着 pH 值的增加而显著增加。在 7.0–11.0 的 pH 范围内，观察到 OCR 降低，pH 值进一步升高，这表明了明显的负面影响。这些结果清楚地表明， 大肠杆菌的呼吸活动对 pH 值敏感。测试 pH 值（7.0）用于后续实验。pH 值和温度对大肠杆菌代谢活性都有显著影响。因此，在评价重金属离子毒性之前，应排除 pH 和温度的潜在抑制作用。

图1 测试条件优化。(A) 不同浓度大肠杆菌在无Hg²⁺或含20 µg/mL Hg²⁺溶液中的典型耗氧曲线。(B) 不同大肠杆菌浓度下的氧消耗速率（蓝色）和灵敏度指数（红色）。(C) 温度对大肠杆菌OCR的影响（大肠杆菌浓度：5.0 × 10⁷ cfu/mL，pH=7）。(D) pH对大肠杆菌OCR的影响（大肠杆菌浓度：5.0 × 10⁷ cfu/mL，温度：37℃）。

2. 使用细菌培养物进行 Hg 2 + 毒性检测

确定了最佳检测参数后，使用便携式微生物全细胞生物传感平台进行急性 Hg2+ 毒性检测。使用空气饱和水将大肠杆菌培养物稀释至 5.0 × 107 CFU/mL。加入 0.5 mL Hg2+ 溶液后，最终 Hg2+ 浓度为 0–22.0 μM，使用手持式光纤溶解氧传感器实时检测血氧饱和度。用各种 Hg2+ 浓度处理的大肠杆菌的典型耗氧量迹线如图所示。含 Hg2+ 的处理样品的 OCR 显著降低，低于不含 Hg2+ 的对照样品。这有助于通过抑制代谢活性来抑制毒性 Hg2+ 的大肠杆菌呼吸，从而限制细胞活动，甚至导致细胞死亡。当 Hg2+ 浓度高于 400 nM 时，没有大肠杆菌可以在 LB 培养基中生长。然而，仍然可以在 Hg2+ 的实验浓度范围内观察到耗氧量，远高于 400 nM。研究人员分析，这是因为在平板计数法中，Hg2+ 与大肠杆菌之间的相互作用时间持续超过 12 h，较低浓度的 Hg2+ 可导致大肠杆菌死亡。然而，在他们提出的方法中，相互作用时间非常短 （< 20 min），大肠杆菌的代谢活性得以维持，它们的呼吸没有被完全抑制。

图2 使用便携式微生物全细胞生物传感平台检测 Hg2+ 的毒性。（A） 各种 Hg2+ 浓度下的典型耗氧量痕迹。（B）Hg 2+ 毒性检测的剂量反应曲线（大肠杆菌浓度为 5.0 × 107 cfu/mL，pH = 7，温度为 37 °C）。

上图显示了 Hg2+ 对大肠杆菌呼吸抑制的剂量反应曲线，使用四参数模型绘制了 OCR 与 Hg2+ 浓度的关系图。B 中的误差线对应于三组平行实验中数据点的标准差，均小于 6.3%，表明便携式微生物全细胞生物传感器用于 Hg2+ 毒性检测具有良好的稳定性。从图中可以看出，使用平均空白值标准偏差的三倍测定 Hg2+ 的检测限 （LOD） 为 5.62 μM，IC50 值为 11.64 μM。 下表比较了在类似条件下使用拟议的生物传感器与其他生物传感器的 Hg2+ 的相对毒性值。可以看出，所提出的生物测定的灵敏度与其他方法的灵敏度相当。

表1 便携式全细胞生物传感平台与其他生物传感器在Hg²⁺毒性检测中的性能对比

3. 迈向通用的急性毒性检测平台

为了证明便携式全细胞生物传感平台的一般适用性，还在最佳条件下通过细菌培养评估了其他三种重金属（包括 Pb2+、Zn2+ 和 Cu2+）的毒性。它们的检测过程与 Hg2+ 相似。 大肠杆菌浓度为 5.0 × 107 CFU/mL，检测时间为 18 min。 图中显示了不同重金属离子浓度下的典型耗氧量曲线。正如预期的那样，重金属离子浓度的增加导致 OCR 成比例地减少。

图3 采用便携式微生物全细胞生物传感平台检测Pb²⁺、Zn²⁺和Cu²⁺的毒性。（A-C）分别为不同浓度Pb²⁺、Zn²⁺和Cu²⁺作用下的典型耗氧曲线；（D）三种重金属离子毒性检测的剂量-效应曲线（大肠杆菌浓度5.0×10⁷ cfu/mL，pH=7，温度37℃）。

图中显示了大肠杆菌呼吸抑制中三种重金属离子的剂量反应曲线，分别绘制了 OCR 与 Pb2+、Zn2+ 和 Cu2+ 浓度的关系图。Pb2+、Zn2+ 和 Cu2+ 的 IC50 值分别为 323.6、565.0 和 859.2 μM，均高于 Hg2+。根据测得的 IC50 值，四种重金属离子的毒性可以按降序排列：Hg2+ > Pb2+ > Zn2+ > Cu2+。三种金属离子的 IC50 值与其他方法的 IC50 值高度相似。其他方法通常需要更长的分析时间；相反，所提出的方法只需要 18 min。上述结果表明，所提出的微生物全细胞生物传感器用于重金属离子的生物危害和毒性分析的可扩展性。

监测模式生物的呼吸作用并研究外部毒物诱导的代谢变化，可以评估和排序重金属离子毒性。 除此之外，所提出的方法还具有其他几个优点。首先，便携式微生物全细胞生物传感器的小型化、移动性和灵活性有利于通过简单的作快速（18 分钟）现场检测重金属离子的毒性。其次，无需使用昂贵的仪器和试剂即可实现重金属离子的现场高通量毒性检测。在实际应用中，只需要对 DO 进行末端检测，本实验提出的方法对于重金属离子的高频、高通量毒性检测是可行的，有利于重金属污染的预警和快速检测。第三，便携式微生物全细胞生物传感平台非常便宜（仅 300 美元），每次测试只需 0.05 美元。因此，发展中国家和资源有限的地区可以负担得起。此外，基于微生物细胞呼吸活性的重金属离子毒性检测不受样品浊度、吸收光或猝灭发光效应的影响，有利于获得更准确的结果。

4.使用冻干菌进行 Hg^2+ 毒性检测

全细胞生物传感器的长期活性和活力对于基于细胞的设备的开发及其在常规环境监测中的广泛实际应用至关重要，特别是在偏远 、资源匮乏的环境中。由于缺乏细胞生长，冻干是长期保存细菌的最有效方法之一，它也有利于即用型检测。

使用冻干细菌检测 Hg2+ 的毒性机制与细菌培养相似，只是使用了冻干的大肠杆菌。最初将 4.0 mL 空气饱和水加入样品管中进行再水化。引入 1.0 mL 对照样品或含 Hg 2+ 的样品后，使用手持式光纤 DO 传感器实时检测血氧饱和度。首先，研究人员评估了冻干大肠杆菌的回收性能。有趣的是，在引入空气饱和水后，冻干大肠杆菌的呼吸迅速恢复，无需预先复苏。特别是，水样中的氧气在 18 min 内完全耗尽，有助于很好地保存样品中大肠杆菌的活性和活力。平板计数法显示，空气饱和水制备的冻干大肠埃希菌回收后浓度约为 1.5 × 108 cfu/mL。

图4 使用冻干大肠杆菌进行 Hg2+ 毒性检测。（A） 不同浓度 Hg2+ 的典型耗氧量痕迹。（B）Hg 2+ 毒性检测的剂量反应曲线（pH = 7，温度为 37 °C）。

冻干的大肠杆菌用于 Hg2+ 毒性检测。 与细菌培养类似，当水样中加入 Hg 2+ 时，冻干大肠杆菌的 OCR 显著降低。这表明冻干大肠杆菌的呼吸活性也受到毒性 Hg 2+ 的极大抑制。较高浓度的 Hg2+ 导致对大肠杆菌呼吸的抑制更大。 图中的误差线小于 5.9%，表明便携式微生物全细胞生物传感平台对使用冻干细菌进行 Hg2+ 毒性检测也具有良好的稳定性。使用冻干菌测定的 Hg2+ 的 LOD 和 IC50 值分别为 13.18 μM 和 31.28 μM。冻干细胞的 IC50 略高于细菌培养，但也与以前的报道具有高度可比性。这些结果清楚地表明，冻干的大肠杆菌可用于重金属离子的快速现场毒性检测，而无需预先复苏。这种表现与其他需要过夜恢复的报告完全不同。 为了评估稳定性和可重复性，研究人员使用所提出的细胞生物传感器连续检测 Hg2+ 10 次，获得了良好的一致性，RSD 小于 10%。这些结果表明，该方法对生物传感器的即用型应用有很大的好处。

此外，保持细菌全细胞生物传感器的活力和灵敏度是评估其潜在长期功能的最重要特征之一。 在 4 °C、-20 °C 和 -80 °C 下长期储存后，评估冻干大肠杆菌的性能。 首先，在不同储存时间后测量冻干大肠杆菌在三种储存温度下的呼吸活性。下图显示了冻干大肠杆菌根据储存温度的不同 OCR。冻干大肠杆菌在 4 °C 和 -20 °C 下储存时，其 OCR 随着储存时间的延长而降低。 储存一个月后，在 4 °C 和 -20 °C 下 18 min 的 OCR 分别下降到 70.1% 和 35.2%。然而，当冻干的大肠杆菌在 −80 °C 下储存时，OCR 仅显示略有下降 （<5%），即使在 1 个月后也是如此。先前的研究表明，冻干培养物中残留的水可能会导致冻干细胞在储存过程中部分再水化和失活。因此，在 -80 °C 下储存更有利于保持细菌细胞的活性。

图5 冻干大肠杆菌的储存稳定性研究。（A）冻干大肠杆菌在-80℃不同储存时间下的典型耗氧曲线；（B）冻干大肠杆菌在-20℃不同储存时间下的典型耗氧曲线；（C）冻干大肠杆菌在4℃不同储存时间下的典型耗氧曲线；（D）不同储存温度下冻干大肠杆菌在第18分钟的氧消耗速率（OCR）；（E）采用-80℃不同储存时间的冻干大肠杆菌检测Hg²⁺毒性的剂量-效应曲线。

为了研究冻干全细胞生物传感器随时间推移的性能，在 -80 °C 下储存 15 天和 30 天后，使用冻干大肠杆菌进行 Hg2+ 毒性检测。 剂量 - 反应曲线如图 S5E 所示，与冻干 24 小时后获得的剂量-反应曲线进行比较，作为基准参考。冻干大肠杆菌贮藏 1 d、15 d 和 30 d 后的 IC50 值分别为 29.5 μM、30.8 μM 和 28.8 μM，贮藏 1 个月无显著变化。

5.真实水样的毒性检测

为探索便携式微生物全细胞生物传感平台在现场的潜在用途，采用大肠杆菌培养物和冻干大肠杆菌对实际水样进行 Hg2+ 毒性检测，包括自来水、河水（高粱江）、湖水（中国人民大学逸韶池湖）和污水处理厂（WWTP）。最初研究了四个水样的耗氧能力，因为一些生物可以在这些样品中存活。使用空气使四个水样饱和后，使用手持式光纤 DO 传感器实时测试其 DO 浓度。自来水中氧饱和度几乎没有变化，但其他三个水样在 2 h 后氧饱和度略有下降 （<5%），这应该源于现有生物体的呼吸作用。然而，氧饱和度的这种轻微下降并不影响测量结果，因为重金属离子的毒性检测在 18 min 内完成，大 肠杆菌培养物或冻干的浓度大肠杆菌远高于现有生物体。

图6 三种实际水样在未添加培养菌或大肠杆菌条件下的耗氧能力检测

下图分别显示了使用大肠杆菌培养物和冻干大肠杆菌的四个水样中 Hg2+ 在呼吸抑制大肠杆菌中的剂量反应曲线。当使用大肠杆菌培养时，自来水、河水、湖水和污水处理厂污水中 Hg2+ 对大肠杆菌的 IC50 值分别为 10.35 μM、12.47 μM、11.24 μM 和 12.28 μM。正如预期的那样，对于所有四个水样，使用冻干大肠杆菌的 IC50 值都高于大肠杆菌培养物，自来水、河水湖水和污水处理厂污水的 IC50 值分别为 35.12 μM、37.46 μM、42.35 μM 和 48.15 μM。自来水的 IC50 值略低于其他 3 个水样。各种水基质中生物测定性能的差异可能与它们的水化学特性有关，这可能会影响污染物的生物利用度和毒性，尤其是重金属。此外，水样本中重金属和其他污染物之间的相互作用可能会导致对大肠杆菌的毒性降低或升高。综上所述，所提出的便携式微生物全细胞生物传感平台可以使用大肠杆菌培养物或冻干大肠杆菌直接检测重金属离子的毒性。然而，使用冻干大肠杆菌不仅有利于其长期储存和冷链独立性，而且易于重组以进行快速现场检测。

图7 实际水样毒性检测分析。（A）采用培养态大肠杆菌（浓度5×10⁷ cfu/mL）检测三种加标水样（自来水、湖水及污水处理厂出水）的毒性剂量-效应曲线，加标Hg²⁺浓度梯度为0-25.0 μM；（B）采用冻干大肠杆菌检测相同水样的毒性剂量-效应曲线，加标Hg²⁺浓度梯度扩展至0-80.0 μM（pH=7，温度37℃）。

5. 结论

通过将手持式光纤溶氧传感器与细菌培养或冻干细菌集成，成功构建了一种新型便携式微生物全细胞生物传感平台，用于重金属离子的即用型毒性测定。基于耗氧量抑制机制，可快速实现重金属离子的毒性检测。冻干的大肠埃希菌无需预复苏即可直接用于 Hg2+ 毒性检测，冻干的大肠埃希菌可在 −80 °C 下长期保存，而不会明显损失活性和检测性能。便携式全细胞生物传感平台非常坚固，能够可靠地处理复杂的样品，例如 WWTP 污水或环境水。在实际应用中，未来的工作将集中在所开发的生物传感平台的性能优化上，并验证其在大规模环境样本现场检测中的应用。总之，所提出的微生物全细胞生物传感平台不仅非常适合重金属离子的快速高频现场毒性评估，而且由于其简单、快速、即用型、长期稳定性和灵活性，具有高度可扩展性。

6. 个人总结

通过本篇文献，我学习了别的研究构建一种微生物全细胞生物传感平台的流程和思路，以及大肠杆菌冻干粉的制作思路。

本实验中，因为新构建了OCR检测的设备，所以先进行了建模，计算如何通过读荧光值反映溶解氧情况，进一步计算出重金属离子的浓度。然后测试了检测的条件，确定了37℃和pH 7.0的最佳条件。接下来在实验室条件下对特定类型重金属离子进行检测，比较发现灵敏度和其他检测方式相当。此外，还拓展了检测的重金属离子类型。紧接着又加入了冻干大肠杆菌，测试和实验室直接使用扩培的大肠杆菌有何区别。最后，进行真实水样的检测。

如果我们也要设计硬件的话，可以参考这样的研究思路，进行result和POC的撰写。