IGEM课题分享 | 2024-ULINK-SZ(高中赛道)

XMU-CHINA

1. 课题基本信息

课题名称:

CaraCOS: To produce versatile COS from waste carapace with the application of dual-enzyme synergistic catalysis

主要内容:

通过双酶协调催化从几丁质生产壳寡糖

Wiki 网址:

https://2024.igem.wiki/ulink-sz/home

阅读目标:

了解课题组的课题背景、课题原理、项目设计、实验思路

2. 课题背景

随着中国水产养殖业的发展以及人们生活水平的提高,虾蟹出现在人们的餐桌上越来越多,2023年中国产生了大约560万吨的甲壳类废弃物,带来了严重的环境挑战,包括污染和资源浪费等问题。在发达国家,处理甲壳成本很高,而在发展中国家,它们往往被丢弃,从而加剧污染问题,改变土壤、水和海洋生态系统,导致严重的生态后果。

大多数人和个体经营者都没有意识到回收虾蟹壳的重要性,大多将其作为厨余垃圾一起丢弃。虽然多数虾蟹养殖企业没有回收计划,但大多表示希望回收虾蟹壳。然而,虾蟹壳的回收成本极低。湿虾壳的价格每公斤不到0.10美元,考虑到储存和运输费用后,经济价值很低,无法吸引企业参与。因此,迫切需要开发一种高效利用虾蟹壳的方法,提高这些壳的回收利用率。有助于生产壳寡糖,进而更容易进行加工并应用于更广泛的领域。

团队旨在通过合成生物学方法,利用酶处理将虾蟹壳中的甲壳素转化为有价值的壳寡糖,为废弃物管理提供可持续的解决方案,将副产品转化为具有经济价值的资源。虾蟹壳的主要成分之一是甲壳素,约占20%-30%,其次是40%-50%的无机物(如碳酸钙)和30%-40%的蛋白质。甲壳素是自然界中仅次于纤维素的第二大生物资源。它主要由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)组成。甲壳素经过高度脱乙酰化后得到的聚合物大分子称为壳聚糖,而壳聚糖的主要成分是D-氨基葡萄糖(GlcN)。一般来说,壳聚糖降解后得到聚合度(DP)为2-10的低分子量产物被称为壳寡糖。

壳寡糖是一类具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、降胆固醇、降血压、抗感染和抗炎等生理活性的功能碳水化合物,具有巨大的应用潜力。这些功能在不同的聚合度下有显著差异。目前市场上单一聚合度的壳寡糖价格较高,壳寡糖的功能效果与其DP值密切相关,直接影响其应用价值和效果,因此特定DP值的单一壳寡糖的生物活性备受关注。表1显示了中国市场纯壳聚糖壳寡糖的当前价格,10毫克的价格超过500元人民币。传统的壳寡糖生产方法主要包括物理和化学方法,通常涉及高能耗和复杂的反应条件,且产率和纯度难以保证。相比之下,酶法具有反应条件温和、特异性高的优点,可以有效地将壳聚糖转化为壳寡糖,产生更少的废物,经济效益和环境友好性更好。因此,团队希望通过酶法从虾蟹壳中获得壳寡糖。

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3. 实验原理与基本思路

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项目旨在通过酶促降解几丁质来优化壳寡糖(COS)的生产。首先,使用几丁质脱乙酰酶(CDA)将几丁质转化为壳聚糖,然后利用壳聚糖酶(CsnB)将壳聚糖水解为COS。构建了重组表达质粒pET-28a-CDA和pET-28a-CsnB,并使用Gibson组装方法将基因片段连接到载体上以实现酶的表达。而后研究了CsnB的突变,以分析酶活性和生成的产物,比较了双酶协同催化和逐步催化在COS合成中的效果,探索了最佳催化条件。

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几丁质降解生产壳聚糖也称为酶法制备壳聚糖,几丁质首先在几丁质脱乙酰酶的作用下转化为壳聚糖,然后壳聚糖在壳聚糖酶的作用下转化为寡糖。酶促降解方法具有反应条件温和、工艺控制简单、降解产物分子量分布窄、环境污染少以及无副反应等优点。本项目专注于修饰用于COS酶法制备的酶(CsnB),以优化生产更高纯度COS的过程。

构建方法:

为了实现几丁质到壳聚糖的酶促水解过程,构建了几丁质脱乙酰酶(CDA)的表达质粒。首先选择pET-28a作为表达载体。然后从枯草芽孢杆菌基因组中提取CDA基因,并设计引物CDA-F和CDA-R特异性扩增CDA基因片段。随后,使用Gibson组装方法将扩增的CDA基因片段连接到线性化PET-28a载体上,形成重组质粒pET-28a-CDA。

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壳聚糖酶CsnB基因来源于海洋细菌Bacilius sp. BY01。使用引物CsnB-F和CsnB-R扩增CsnB基因片段。通过Gibson组装将CsnB基因片段连接到线性化pET-28a载体上,获得pET-28a-CsnB。

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为了获得能够水解并产生单聚合度寡糖的壳聚糖酶,团队将使用一系列建模技术预测蛋白质结构,并分析蛋白质与小分子之间的相互作用。之后,对氨基酸序列进行定点突变以获得突变体变种。从NCBI数据库中查找了Bacilius sp. BY01的壳聚糖酶基因CsnB,并使用AlphaFold2进行结构预测。通过阅读文献和相关知识,团队设计了以下突变: V186Y, D78Y, K260W, P115A。在突变之前使用Autodock Vina进行了突变位点与底物之间的对接模拟,并使用PyMOL进行结构可视化分析。

团队选择大肠杆菌作为蛋白质表达的宿主。使用pET-28a质粒作为质粒骨架构建CsnB突变体的载体。表达质粒包含核心组件,如T7启动子、lac操纵子、CsnB突变基因、6×His标签、卡那霉素抗性基因和T7终止子。通过添加IPTG诱导CsnB突变蛋白的高效表达,然后利用6×His标签纯化蛋白,以进行进一步的酶活性测试和产物聚合分析。

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酶活测定:

CDA的酶活性通过比色法进行,这是一种常用的酰胺酶活性定量方法。选择对硝基乙酰苯胺作为底物,其可以被水解为对硝基苯胺。对硝基苯胺的浓度可以通过其在400 nm处的特征吸收来测量。几丁质脱乙酰酶(CDA)活性单位定义为每小时产生1微克对硝基苯胺所需的酶量,即定义为一个单位的酶活性。

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由于壳聚糖的氨基是碱性的,因此使用酸碱滴定来确定脱乙酰度。在反应过程中,形成了一定量的酸与壳聚糖的胶体溶液,未反应的酸可用于与碱进行反滴定,以推断出与壳聚糖自由基结合的酸的量,然后可以计算出壳聚糖中游离氨基的量。

3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定CsnB酶的活性。DNS法测定酶活性的实验原理是基于还原糖与DNS反应生成有色化合物。首先,将酶与底物混合并反应,酶催化底物生成还原糖。反应结束时,加入DNS溶液并加热,生成的还原糖与DNS反应产生颜色变化。通过测定540纳米处的吸光度值,可以反映还原糖的浓度,从而推断出酶活性。酶活性可以通过以下公式获得:

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借助AlphaFold3和AutoDock Vina推进蛋白质工程:

AlphaFold3是由DeepMind开发的一种先进的基于人工智能的蛋白质折叠算法。它利用深度学习和扩散网络,根据氨基酸序列预测高精度的蛋白质结构。该算法从随机原子云开始,通过考虑进化关系和物理约束逐步优化结构,最终生成高度精确的三维模型。其具体方法如下:

  1. 序列准备:Chitosanase CsnB从相关数据库中检索氨基酸序列,下载为FASTA格式。
  2. 运行AlphaFold3:将CsnB序列上传至AlphaFold3,算法生成预测的三维结构,并提供每个残基的置信度分数(pLDDT值),输出获得CsnB的高置信度结构模型
  3. 结构分析:使用PyMOL可视化预测的结构,分析结构特征,如活性位点和结合口袋,通过去除不必要的分子并添加氢原子来准备结构,以便进行分子对接。

AutoDock Vina是一种开源软件,用于预测小分子(如底物或抑制剂)如何与已知三维结构的受体结合。它使用经验评分函数和复杂的优化算法来探索可能的结合模式。其使用方法如下:

  1. 蛋白质和配体的准备:蛋白质(CsnB)使用AutoDockTools去除水分子并添加氢原子;将准备好的蛋白质保存为PDBQT格式,配体(六乙酰氨基葡萄糖)从蛋白质数据库(PDB ID: 4OLT)中检索结构;通过添加氢原子和设置扭转角来准备配体;将配体保存为PDBQT格式。
  2. 设置对接参数:将网格框中心置于CsnB的活性位点上;调整网格大小以包含潜在的结合区域,使用默认设置进行彻底性和能量范围的配置
  3. 运行对接模拟:通过命令行或图形界面运行AutoDock Vina;生成多个对接姿势及其对应的结合亲和力
  4. 分析对接结果:根据结合亲和力得分和相互作用类型评估姿势,使用PyMOL可视化排名靠前的对接姿势;识别关键相互作用,如氢键、疏水作用和π-π堆积作用

结果表明:目标蛋白的结构由上下结构域组成,中间有两个弯曲的螺旋连接,这是GH46壳聚糖酶的典型特征。位于结构域之间的缬氨酸(Val186, V)和酪氨酸(Tyr148, Y)是保守氨基酸,中间的凹槽是催化裂口,用于结合底物壳聚糖。其使用内切降解机制,其主要水解产物为壳二糖((GlcN)₂)和壳三糖((GlcN)₃),不产生单体(GlcN)。此外,CsnB属于GH46壳聚糖酶的II亚类,能够切断GlcN-GlcN和GlcN-GlcNAc键。

基于蛋白质-配体复合物结构和之前成功的突变研究,选择了突变位点。在CsnB蛋白结构中,Pro115 (P)、Val186 (V)、Asp78 (D) 和 Lys260 (K) 靠近壳六糖的 (+3) 和 (-3) 亚位点。Asp78对应于壳聚糖酶OU01中的高保守Ser27残基,参与底物结合,其突变对底物结合有一定影响。Val186 (V) 是CsnB结构域之间的保守氨基酸,而Pro115是靠近 (-3) 亚位点的一个具有刚性、不规则卷曲结构的残基,可能干扰正确的底物相互作用。Lys260的羰基延伸可能因N-乙酰基团造成空间位阻,影响酶-底物结合和催化效率。为了评估这些残基对CsnB酶活性和底物特异性的影响,设计了以下突变:D78Y,引入芳香族相互作用以稳定底物结合;V186Y,增强与糖环的π-π相互作用,K260Y,修改结合亲和力并减少空间阻碍,P115A。增加结合位点区域的灵活性。

接着,团队纯化了四种表达的突变蛋白以及野生型蛋白,以研究酶活性并分析产物纯度。使用大肠杆菌BL21(DE3)以IPTG诱导蛋白质表达,采用Ni-NTA亲和色谱法纯化,通过SDS-PAGE分析确认蛋白质大小和纯度,使用DNS法测量由壳聚糖酶促水解产生的还原糖。野生型CsnB:活性为28.8 U/mL。P115A突变体:与野生型相比,活性增加了15.2%。D78Y和K260Y突变体:显示出降低的活性,但产物谱发生了变化。

薄层色谱法(TLC)分析得到D78Y和K260Y突变体:主要产生壳二糖,表明产物特异性发生了偏移。P115A突变体:整体酶活性增强,但产物分布没有显著变化。

突变体酶的产物分析:

在50°C、pH 6的乙酸-乙酸钠缓冲液中,将CsnB及其突变体与0.5%的胶体壳聚糖孵育24小时。V186Y突变体和野生型CsnB的酶促反应均产生了壳聚糖((GlcN)₂和壳三糖((GlcN)₃)的混合物作为产物。然而,D78Y和K260Y突变体的最终产物主要由(GlcN)₂组成,(GlcN)₃极少。由于D78Y突变体的活性高于K260Y突变体,团队打算探索使用D78Y突变体与几丁质脱乙酰酶协同制备壳聚糖的最佳条件,以获得浓度和纯度更高的壳聚糖。

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酶活性和产物变化机制分析:

在V186Y和D78Y突变体中,原始残基被酪氨酸取代。酪氨酸的苯环可以与糖链形成π-π相互作用,增强底物结合裂隙中糖链的稳定性。然而,这使得高分子聚合度的底物更难在催化裂隙内定位和结合,因为裂隙的闭合程度增加。只有低聚合度的壳寡糖能够顺利通过并释放,而高聚合度的壳寡糖则难以从裂隙中释放出来。因此,D78Y突变体表现出单聚合度产物壳二糖。增加的空间位阻阻碍了酶与底物的结合,降低了这两个突变体的酶活性。对于K260Y突变体,K260的羰基延伸可能与N-乙酰基产生空间位阻。将其突变为酪氨酸后,酪氨酸与糖链之间的π-π相互作用进一步稳定了底物。同时,酪氨酸较大的苯环结构引入了新的空间位阻,限制了高聚合度壳寡糖的结合和释放。K260Y突变体主要产生单聚合度的壳二糖,且酶活性显著降低。至于P115A突变体,原始的脯氨酸残基由于其强烈的刚性,可能会干扰底物的正确结合。将P115突变为丙氨酸增加了无结构卷曲区域的柔韧性,使酶更接近底,提高了酶与底物结合的能力,从而增强了其催化活性。

综上分析,增加的立体障碍可能会降低酶活性,它阻碍了底物的进入和产物的释放。减少的立体障碍可能会通过促进底物结合和产物释放来增加酶活性。π-π相互作用的双重效应:正面效应增强底物在活性位点的定位,提高催化效率。负面效应过度稳定的结合可能阻碍产物释放,降低酶周转率。

双酶催化系统分析:

为了研究CDA和CsnB(D78Y)在胶体几丁质降解中的作用机制,以1%的胶体几丁质为底物,比较并分析了CDA和CsnB(D78Y)分步或协同催化10小时的效果。在相同的反应条件下,CDA和CsnB(D78Y)共同催化10小时可以连续降解60%的胶体几丁质,且协同催化下的降解速率高于两种酶分步催化的速率。

为了探索温度对双酶协同催化系统的影响,在pH 8的条件下,使用不同温度(40, 50, 60℃)和2 g/L的胶体几丁质作为底物,添加50 U/mL的CDA和CsnB(D78Y)进行纯酶反应10小时,并通过HPLC检测壳聚糖的质量浓度。最终得出,双酶共催化系统的最佳反应温度是50℃。

为了研究pH值对双酶协同催化系统的影响,在最佳温度50℃下,将2 g/L的胶体几丁质作为底物,添加50 U/mL的CDA和CsnB(D78Y)进行纯酶反应10小时,在不同pH值(6, 7, 8)下进行实验,并通过HPLC检测产物壳聚糖的质量浓度。双酶共催化系统的最佳反应pH值为7。

为了检验CDA与CsnB(D78Y)的添加比例对双酶系统协同催化效率的影响,我们在标准化的最佳条件(50°C和pH 7)下,以2 g/L的胶体几丁质作为底物,进行了不同混合比例(1:2, 1:1, 2:1)的CDA和CsnB(D78Y)酶促反应。这些反应进行10小时后,通过HPLC定量测定产生的壳二糖浓度。对于协同催化系统,最有效的酶组合比例是CDA与CsnB(D78Y)的1:2比例。

总之,双酶协同催化系统的最佳反应温度是50℃,最佳pH值是7。两种酶的添加比例对催化系统影响较小,最佳比例是1:2。在上述最佳反应条件下,以2 g/L的胶体几丁质作为底物时,产物(GlcN)₂的浓度为1.76 g/L。

团队未来打算:

通过分子动力学模拟,探究突变位点如何影响酶的结构稳定性和底物结合能力。深入探索酶活性与产物纯度之间的内在机制。设计新的突变位点,特别是活性中心和底物通道区域的氨基酸残基,希望获得具有更高活性或更高纯度合成产物的酶。产品纯化和功能评估:对生成的壳寡糖进行纯化和表征,分析其分子量分布和纯度,并评估其在医药、食品及其他领域的生物活性和应用潜力。探索新的协同系统:多酶协同作用:引入其他相关酶类,与优化后的CsnB突变体和CDA共同作用,构建一个更高效的生物催化系统。开发虾蟹壳废料的绿色处理方法:进一步转化和应用这些废料,实现资源的可持续利用。

4. HP部分

问题:

回收这些废弃的虾蟹壳有多困难?公众和相关企业的态度如何?政府在未来是否会支持这类项目的发展?

政策调研:

政府管理者访谈:彭晨,广东省清洁生产协会副会长

协会和政府普遍关注三种类型的废弃物:工业源、农业源和社会源。其中社会源废弃物种类繁多、涉及范围广且处理复杂,因此政府现大力扶持企业对废弃物进行回收,尤其鼓励他们开发新技术。作为政府工作人员,会长十分关心项目对民众的影响。首先,他指出虽然壳寡糖在医药和食品领域有很高的价值,但公众可能对以餐饮垃圾为原料生产的产品存在顾虑。因此,推广此类产品时需要考虑公众接受程度,并且可能需要投入大量宣传和教育工作。其次,他强调在处理与居民生活密切相关的社会垃圾时,必须充分考虑居民的感受和参与度。这意味着在推进虾蟹壳回收项目时,需要有针对性地设计公众参与和教育方案。

总体而言,会长的态度表明,虽然政府对这类项目持开放态度,但项目成功不仅取决于技术可行性,还取决于经济成本、公众接受度和居民参与度等多种因素的结合。

从政策制定角度来看,中国对食物垃圾的管理与利用持续加强并不断完善。特别是2024年的政策文件提到要提高废弃物回收和再利用水平。作为食物垃圾的一部分,虾蟹壳的回收和利用符合上述政策趋势。此外,虾蟹壳富含蛋白质、碳酸钙和甲壳素等有用化学物质,具有很高的资源化利用价值,有望成为未来关键废弃物之一。在政策支持方面,国家鼓励资源回收产业的发展,并提供税收优惠、财政支持和技术支持等措施。这为虾蟹壳回收提供了良好的政策环境和市场机遇。

中国各地根据实际情况出台了一系列固体废物管理和资源回收政策,特别是在沿海地区,由于水产养殖和渔业活动密集,废物回收和处理设施相对完善,回收率较高,约为20%到30%。在虾蟹壳中,甲壳素含量丰富,可用于生产多种化学品和材料。如果虾壳和甲壳素的比例分别为60%和25%,那么2023年中国虾蟹产品中废弃的甲壳素高达141万吨。然而,大多数虾蟹壳被填埋或焚烧处理,不仅对环境造成严重污染,也是巨大的资源浪费。

消费者和餐馆调查:

在中国,垃圾分类已成为深入人心的政策和日常习惯。在这一体系下,废弃的虾蟹壳通常被归类为厨余垃圾。然而,公众对这些看似无用的废弃物实际上具有可回收价值的认识仍然不足。为了验证这一假设,团队进行了问卷调查和访谈,深入了解公众的真实想法,关注公众对于将虾蟹壳转化为壳寡糖并应用于日化产品和医药行业的接受度和看法。

调查结果揭示了几个关键点:

虾蟹壳的处理方式:绝大多数受访者(72.7%)将虾蟹壳作为厨房垃圾丢弃,反映出公众对虾蟹壳潜在价值的认识不足。然而相当一部分受访者(14.9%)已经意识到虾蟹壳的可回收性,这表明公众对环保和资源回收价值的逐渐认识。

回收态度:公众对虾蟹壳的回收持积极态度,86.6%的受访者表示愿意在垃圾分类时分离虾蟹壳以便回收。这一高比例的积极回应显示了公众对提高回收率的支持和参与意愿。

产品接受度:尽管受访者对由虾蟹壳回收制成的产品的了解程度不高(40.45%的受访者表示不知道甲壳素和壳寡糖的应用情况),但在接受度方面,55.56%的受访者表示愿意接受和使用这些产品。这表明尽管知识水平有待提高,但公众对新型环保产品持开放和积极态度。但约17%的受访者不太能接受或完全不接受使用这些产品。

利益相关调查:

在对龙虾餐馆的实地调研中,团队深入了解了餐饮界目前对虾蟹壳回收的现状和态度。调查结果显示,目前餐饮企业普遍将虾蟹壳与厨房垃圾混合处理,并未进行单独分类。这种做法反映出行业对虾蟹壳回收的认识还处于初级阶段。餐饮从业者普遍表示不知道虾蟹壳可以回收利用。当被问及地方政府是否有可能建立专门的回收机制时,他们表示愿意支持这一举措,但前提是不影响日常运营和经济效益,不过对这种新模式的可行性和可靠性仍存有疑虑。

企业访谈:武汉大学邓红兵教授

专门从事大闸蟹的养殖和销售企业:据了解,它们尚未实施蟹壳回收计划。据顾先生介绍,不合格的大闸蟹一般在剥壳后直接沉入湖中,这是最简单、成本最低的方法。合格的大闸蟹则进入消费市场,但由于销售点分散,这成为一个挑战。关于如何提高家庭消费者对蟹壳回收的积极性,他提出了创新性的见解。可以通过激励机制来鼓励消费者参与,例如通过单独处理虾蟹壳垃圾获得碳积分,这样不仅可以提高回收率,还能增强消费者的意识和参与感。这种以激励为导向的方法可能是促进虾蟹壳回收的有效途径。

专家建议:

邓教授也强调了虾蟹壳回收的重要性,他指出这是一个越来越受到关注的话题。传统的处理方法不仅给环境带来负担,还没有充分发挥这些废弃物的资源潜力。因此,人们正在积极探索一系列创新技术和方法,其中甲壳素的提取和应用就是一个典型例子。这种物质不仅有广泛的应用前景,还可以有效提升虾蟹壳的利用价值。

在讨论回收机制时,邓教授提出了建设智能回收系统的前瞻性建议。他建议利用智能设备结合区块链技术创建一个透明高效的虾蟹壳回收跟踪系统。这样的系统可以确保回收过程的可追溯性和数据透明度,从而激励企业和消费者更积极参与回收工作。通过智能化和技术创新,可以为虾蟹壳的回收开辟一条新路径,推动这个领域向更加可持续的方向发展。

邓教授建议采用绿色且环保的技术提取甲壳素,例如酶法。他推荐了一种结合甲酸和耐酸蛋白酶的一步发酵工艺,该工艺可以实现超过99%的脱矿质和超过95%的脱蛋白。甲壳素是项目中最重要的底物。邓教授的建议帮助团队明确了底物处理的重要思路和方法。团队将这种方法作为未来研究的首选方案,以降低成本并减少对环境的影响。

他强调了选择合适酶类(如壳聚糖酶)降解甲壳素的重要性,并优化反应条件(pH值、温度、酶浓度),以提高壳寡糖的产量和纯度。他还强调了由于酶活性对反应条件的敏感性,需要进行全面酶筛选。

受邓教授启发,团队一步研究了壳寡糖的纯度和商业价值。在不同领域对壳寡糖纯度的要求有所不同:制药领域的纯度要求高于95%,食品和化妆品行业要求高于90%,而农业领域的要求会更低。不同应用领域可能需要特定聚合度的壳寡糖。例如,高聚合度的壳寡糖可能更适合作为药物传递系统的一部分,而低聚合度的壳寡糖可能更适合作为食品添加剂。高纯度、特定聚合度的壳寡糖能够更好地满足这些特定应用的需求。因此,开发具有更高商业价值的壳寡糖将进一步加强虾蟹壳废物回收的过程,并促进企业政府在这一工作上的投资意愿。基于上述信息,我们将研究重点放在高纯度、单一聚合度的壳寡糖生产上。生产壳寡糖的关键在于CsnB,因此团队将研究重点放在CsnB的改性上。同时,为了简化流程并提高生产效率,团队设置了实验以优化培养条件和酶活性。

未来方案设计:

与水产品加工企业建立直接合作关系,通过提供技术和资金支持,鼓励它们在生产过程中分离和回收虾蟹壳。集中处理设施:在水产品加工区附近设立虾蟹壳集中回收和处理设施,以便于高效收集和处理。政策激励:利用政府支持和激励措施,如税收减免、补贴等,降低企业参与回收的成本。

对于个人和社区:在社区内推广虾蟹壳回收计划,通过设置专门的回收容器和定期回收服务,方便居民参与。开展教育和宣传活动,提高居民对虾蟹壳回收价值的认识,并鼓励他们参与回收活动。实施奖励制度,如积分、优惠券或小礼品,以鼓励居民参与虾蟹壳的分类和回收。

处理方式:由水产品加工企业收集的虾蟹壳废料可能具有高质量规范,适用于高附加值产品,如医疗用品、化妆品、食品等;家庭厨房和餐馆收集的虾蟹壳废料质量可能因收集和处理方式而异,适用于对原材料要求较低的产品,如植物生长促进剂、环保材料、饲料添加剂等农业领域。

教育与宣传方面:

为确保项目的成功,团队设计一系列公共教育活动,以提高公众对循环经济的认识,并着重解决公众对壳寡糖产品来源的担忧。通过线上线下宣传以及与学校和社区的合作,增加公众对绿色产品的接受度,并在社会中推广可持续发展理念。

团队在南京浦口区的两个社区进行了公共宣传,向社区中的老年人和儿童介绍了创新项目。苏州一些社区的回收工作人员向团队展示了垃圾如何变成高价值产品。向他们传达了废物回收、绿色产品和可持续发展的理念。公众对这些外展活动中的创新项目给予了充分的兴趣和支持,社区活动应该继续定期进行。团队计划在寒暑假期间到周边社区开展更多的宣传活动。在设计宣传活动时,将更加注重与居民的互动。

在学校里,团队与学校的MUN社区组织进行了讨论,该组织在学校已经建立了很长时间,并拥有一定的群众基础。社区成员非常支持项目,并认为它非常可持续。因此,他们表示愿意在未来再次合作。团队讨论了寻找合适的机会共同策划一场关于“绿色产品”的展览,以促进更多人了解废物回收和循环经济。

5. 个人总结

实验部分:

选择此文章是因为其研究方向恰好也是甲壳素降解,与我们所做的课题壳聚糖的降解较为符合。

本篇文章思路设计通过两种酶联用(即CDA将甲壳素变成几丁质,CsnB将几丁质变成壳寡糖),完成实验。体系做的是将两种酶通过菌株外泌,而后再做收集,所测得结果确实为同时催化效率更高。

并且通过alpha fold建立CsnB结构,加上壳寡糖预测结合位点,以此确认催化活性位点,接着特异性改造CsnB产生突变体,以期提高酶效率或者获得更纯的产物。

但其问题在于设计的CsnB催化活性不高,最高仅有28.8U/mL,而且最后所获得的特异性产生更纯的产物的酶活性更低,且没有做定量分析,仅做了半定量测定。

因此本课题核心创新点有二:

1. 通过双酶协调催化,获得较高产率‘

2. 通过alpha fold等软件进行预测位点的突变,找到可能提高酶活性的位点。

对目前课题启示:

1. 用相关软件预测壳聚糖酶的结构,通过机器学习可否优化反应活性,甚至得到更纯产物?/预测ChsR结构,探索改造可能,改变筛选的壳寡糖种类?

2. 课题中的半定量分析方法可以借鉴。

3. HP可以适当做参考:要加强市场调研,设计与企业管理者/问卷调查的方案

4. 讲好可持续发展和环保两个方向

【竞赛报名/项目咨询+微信:mollywei007】

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